实验三 等电聚集电泳测定乳酸脱氢酶等电点本实验要求掌握聚丙烯酰胺凝胶等电凝胶电泳原理、超薄型水平板式电泳操作技术及测定蛋白质等电点的方法。一、实验原理蛋白质是两性电解质，当PH >pI时带负电荷,在电场作用下向正极移动:PH >PI时带正电荷,在电场作用下向负极移动：PH=PI时净电荷为零，在电场作用下既不向正极移动也不向负极移动，此时的PH值即是该蛋白的PI值。各 展开
实验三 等电聚集电泳测定乳酸脱氢酶等电点本实验要求掌握聚丙烯酰胺凝胶等电凝胶电泳原理、超薄型水平板式电泳操作技术及测定蛋白质等电点的方法。一、实验原理蛋白质是两性电解质，当PH >pI时带负电荷,在电场作用下向正极移动:PH >PI时带正电荷,在电场作用下向负极移动：PH=PI时净电荷为零，在电场作用下既不向正极移动也不向负极移动，此时的PH值即是该蛋白的PI值。各种蛋白质中由不同种类的氨基酸一不同的比例组成，因而有不同的等电点，这是其固有的理化常数。利用聚丙烯酰胺凝胶（PAA）为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体（Carrierampholytes）造成由阳极到阴极平滑连续PH梯度，在电场作用下蛋白质在PH梯度凝胶中泳动，而浓缩成狭窄的区带，这就是IEF-PAGE。IEF-PAGE成功的关键因素是，包括PAA、两性电解质载体、电极溶液、样品预处理、加样方法、电泳因素以及测定PH梯度和染色方法等。1．PAA是一种人工合成的凝胶，其孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于Acr和Bis总浓度及其百分比。实验证明比例为29：1，浓度在0.5-20%范围的凝胶最为常用。凝胶的有效孔径一般随着凝胶浓度的增加而减少，可根据要分离的蛋白质的分子量大小选择适宜的凝胶浓度（见表一）。另外，Acr和Bis的纯度也极为重要。若不纯，常引起IEF-PAGE的PH梯度向阴极漂移（可能与电内渗有关），从而影响PI值的测定，故应选用重结晶分析纯Acr和Bis。配好的贮液应置于棕色瓶中，4度保存且存放期不超过1-2月为宜。丙烯酰胺总浓度（%） 蛋白质分子量范围(KD)15 12-4310 16-687.5 36-945.0 57-2122.两性电解液载体是IEF-PAGE中最为关键的试剂，它直接影响PH梯度的形成及蛋白质的聚焦。目前常用的两性电解液载体由一系列脂肪族多氨基多羧酸的同系物和异构物组成。由于结构中氨基和羧基的比例不同，它们在PH3-10范围内具有不同但是相近的PK和PI值，因而在电场作用下形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑而连续的PH梯度，而且具有足够的缓冲能力和良好的电导。在此PH梯度下，各种蛋白质无论处于凝胶的何种位置，均移向并停留在其PI处，保持动态平衡。一般溶液的浓度为40%或20%，其PH范围分别为2.5-5，4-6.5，5-8，6.5-9，8-10.5，3-10的等。因此，IEF-PAGE分离蛋白质并测定PI时，可先选用PI为3-10的广谱型两性电解质载体（在凝胶中，其终浓度为2%），在选择较窄范围的两性电解质载体进一步精确测定样品的PI。 3.电极溶液：阴阳电极溶液的作用是避免样品及两性电解质载体在阴极还原或在阳极氧化，其PH值应比形成PH梯度的阴极略高，比阳极略低。PH梯度范围的不同，相应选择的电极溶液也不同。4.样品的预处理和加样方法。盐离子可影响PH梯度形成并使区带扭曲。为防止其影响，不纯样品应透析或用SephadexG-25脱盐。有颗粒物时引起电泳条带拖尾或出现竖带，固体样品要充分溶解。对水或低盐溶液中难溶的蛋白质，可用1%甘氨酸或2%的两性电解质溶解，也可在凝胶和样品中加入同样浓度的尿素、无离子去污剂或两性离子去污剂。加样量2取决于样品中蛋白的种类、数目以及检测方法的灵敏度。如用考马斯亮蓝R250染色加样量为0-150ug；如用银染色加样量为1ug。一般样品浓度以0.5-3mg/ml，最适合加样体积为10-30ul。5.电泳因素：在IEF-PAGE中，一般选用低恒压——恒流——高恒压的电泳方式。低恒压的目的是首先形成凝胶本身的PH梯度，在恒流则防止电流过大，因为强电流可产生很高的热量从而导致凝胶中水分迅速蒸发及蛋白样品变性。随着样品迁移至PI处，样品自身所带电流逐渐减少，电压升高故选用高恒压电泳至电流回零。为保证样品生物活性不改变，电泳应在4-10度下进行。 6.测定PH梯度：本实验采用浸泡法。电泳后，顺着电泳方向切下若干份胶条，分别浸泡于少量重蒸水中测定各管PH值。以PH值为纵坐标，距离（cm）为横坐标绘制PH梯度曲线。此法受到环境中二氧化碳的干扰，影响碱性端PH梯度的测定。其他的方法还有表面微电极测定法和已知等电点标准蛋白质测定法。6.染色：蛋白质染色种类繁多，各种染色原理不同，灵敏度各异。本实验选用考马斯亮蓝R250染色法，该染料是通过范德华力和蛋白质结合，尤其适用于微量蛋白质染色。二、实验步骤安装平板电泳装置(注意调平)配置凝胶灌胶上样(标准LDH5ul,凝胶过滤液20ul)电泳(4℃冰箱60V,15min,改为6mA,30min继续电泳580V,1-2h至15min电流不降为止)浸泡法PH梯度测定考马斯亮蓝R250染色(固定30min,脱色2min,染色30min脱色至条带清晰,4℃保存)测定LDH的PI三、实验结果用浸泡法测定从阳极到阴极0.5cm间隔胶片的PH梯度值，数据如下表所示。根据数据绘制PH曲线。距离cm 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6PH值 3 3.5 4 4.5 4.8 5.1 5.4 6.2 7 7.5 8 8.5 拟合得到PH曲线方程：y = 0.9965x + 2.3864 R2=0.9872根据染色后的区带距阳极的长度，查PH曲线找出相对应的PI值如下表所示： 距离(cm) PI值标准LDH 5.3 7.67凝胶过滤液 2.4 4.78<br/><br/><font color=#0556A3>参考文献：</font>我的研究生作业 哈 收起
